P53特异性抑制剂PFT-α诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.002

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (1): 9-16.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.002

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

P53特异性抑制剂PFT-α诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

燕学波¹，胡朝晖¹，杜运华¹，吕安林²，邢玉洁²

1 解放军第一五四中心医院心内科，河南省信阳市 464000
2 解放军第四军医大学西京医院心内科，陕西省西安市 710032

收稿日期:2012-04-01 修回日期:2012-04-18 出版日期:2013-01-01 发布日期:2013-01-01
通讯作者: 吕安林，博士，副主任医师，副教授，解放军第四军医大学西京医院心内科，陕西省西安市 710032 lvanlin@fmmu.edu.cn
作者简介:燕学波★，男，1979年生，湖北省天门市人，汉族，2011年解放军第四军医大学毕业，硕士，主治医师，主要从事冠心病基础和临床研究。 yanxuebo1979@gmail.com

Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into cardiomyocyte-likecells induced by P53 specific inhibitor p-fifty three inhibitor-alpha

Yan Xue-bo¹, Hu Zhao-hui¹, Du Yun-hua¹, Lü An-lin², Xing Yu-jie²

1 Department of Cardiology, No.154 Central Hospital of Chinese PLA, Xinyang 464000, Henan Province, China
2 Department of Cardiology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University of Chinese PLA, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China

Received:2012-04-01 Revised:2012-04-18 Online:2013-01-01 Published:2013-01-01
Contact: Lü An-lin, Doctor, Associate chief physician, Associate professor, Department of Cardiology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China lvanlin@fmmu.edu.cn
About author: Master, Attending physician, Department of Cardiology, No.154 Central Hospital of Chinese PLA, Xinyang 464000, Henan Province, China yanxuebo1979@gmail.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：最新研究表明，P53可通过阻断P53-P21蛋白通路，显著提高干细胞分化率。而5-氮杂胞苷主要通过激活P53-P21蛋白通路，抑制细胞增殖，导致细胞凋亡。
目的：观察P53特异性抑制剂PFT-α对大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。
方法：分离SD大鼠骨髓间充质干细胞进行培养、传代，取第4代细胞分为4组，正常对照组、PFT-α组、5-氮杂胞苷组及PFT-α+5-氮杂胞苷组。
结果与结论：原代培养的骨髓间充质干细胞传代诱导后细胞体积变大，呈长梭形，排列趋一致。当PFT-α浓度≤ 20 μmol/L时，能减少骨髓间充质干细胞凋亡。心肌样细胞鉴定结果显示，诱导后4周时，可见正常对照组少量表达肌钙蛋白Ⅰ和CX-43，其余3组均强表达。心肌细胞分化率结果显示，诱导4周时，PFT-α组和5-氮杂胞苷+PFT-α组显著高于5-氮杂胞苷组。Western Blotting检测结果示，诱导1周时，5-氮杂胞苷组P53、P21表达最强，PFT-α组几乎不表达；诱导4周时，5-氮杂胞苷组、PFT-α组、PFT-α+5-氮杂胞苷组P53、P21表达明显高于正常对照组。PFT-α组、PFT-α+5-氮杂胞苷组内诱导4周时P53、P21表达量均高于1周时表达。提示通过P53抑制剂PFT-α阻断P53-P21蛋白通路，能显著减少骨髓间充质干细胞凋亡，促进其增殖，且能诱导其向心肌样细胞分化。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, PFT-α, 骨髓间充质干细胞, P53-P21蛋白通路, 5-氮杂胞苷, 心肌样细胞, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Latest researches have shown that P53 can significantly increase the differentiation rate of stem cells by locking the protein pathway P53-P21. While 5-azacytidine can inhibit cell proliferation and lead to apoptosis by activating the P53-P21 protein pathway.
OBJECTIVE: To investigate the effects of P53 specific inhibitor p-fifty three inhibitor-α on differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into cardiomyocyte-like cells.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were separated from Sprague-Dawley rats for culturing and passage. Passage 4 bone marrow mesenchymal stem cells were divided into four groups: normal control group, p-fifty three inhibitor-α group, 5-azacytidine and p-fifty three inhibitor-α+5-azacytidine group.
RESULTS AND CONCLUSION: Primary bone marrow mesenchymal stem cells were smaller, and after passaged and induced, the cells were larger than primary cells and exhibited spindle-shaped appearance and arranged in order. MTT assay showed that p-fifty three inhibitor-α at 0-20 μmol/L could reduce the apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells. Identification results of cardiomyocyte-like cells showed that after induced for 4 weeks, little expression of cardiac troponin Ⅰ and CX-43 could be seen in the normal control group, and the expression of cardiac troponin Ⅰ and CX-43 in the other three groups was strong. After induced for 4 weeks, the differentiation rate of cardiomyocyte-like cells in the p-fifty three inhibitor-α and p-fifty three inhibitor-α+ 5-azacytidine group was significantly higher than that in the 5-azacytidine group. Western blotting analysis showed that at 1 week after induction, the expression of P53 and P21 in 5-azacytidine group was strongest compared with the other groups, but no expression was observed in p-fifty three inhibitor-α group. At 4 weeks after induction, the expression levels of P53 and P21 in 5-azacytidine group, p-fifty three inhibitor-α group and p-fifty three inhibitor-α+5-azacytidine group were higher than those in the normal control group. The expression levels of P53 and P21 in p-fifty three inhibitor-α group and p-fifty three inhibitor-α+5-azacytidine group at 4 weeks after induction were higher than those at 1 week after induction. It indicates that P53 specific inhibitor p-fifty three inhibitor-α can significantly induce the apoptosis, promote the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells through blocking P53-P21 protein pathway, and inhibit bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into cardiomyocyte-like cells.

Key words: stem cells, bone marrow stem cells, p-fifty three inhibitor-α, bone marrow mesenchymal stem cells, P53-P21 protein pathway, 5-azacytidine, cardiomyocyte-like cells, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

燕学波，胡朝晖，杜运华，吕安林，邢玉洁. P53特异性抑制剂PFT-α诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(1): 9-16.

Yan Xue-bo, Hu Zhao-hui, Du Yun-hua, Lü An-lin, Xing Yu-jie. Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into cardiomyocyte-likecells induced by P53 specific inhibitor p-fifty three inhibitor-alpha[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(1): 9-16.

图/表（结果） 7

本文图片，见干细胞图库 http://www.crter.org:8080/Jweb_zzgc/CN/folder/folder1913.shtml

2.1 骨髓间充质干细胞培养传代及诱导后细胞形态学变化原代骨髓间充质干细胞呈圆形，折光性强。3 d后大部分细胞贴壁，体积较小，形态多样，且伸出长短不一、粗细不等的胞质突起互相连接，见图1a。5-7 d后，贴壁细胞迅速分裂增殖，数量明显增多，以长梭形为主，呈放射状向四周扩展。传代后细胞体积较原代细胞大，呈长梭形，混杂少量的三角形或多角形细胞，见图1b。诱导4周后，骨髓间充质干细胞紧密排列呈长梭形，细胞形态均一，趋向一致，见图1c。

图1 骨髓间充质干细胞培养、传代及诱导过程中的形态变化

Figure 1 Morphological changes of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) during culture, passage and induction

2.2 不同浓度PFT-α对骨髓间充质干细胞增殖的影响实验结果显示，当PFT-α浓度≤20 μmol/L时，对骨髓间充质干细胞的增殖有一定促进作用，而当其浓度达到 40 μmol/L时，PFT-α则可明显抑制骨髓间充质干细胞的增殖，与0，10，20 μmol/L PFT-α组比较差异有显著性意义(P < 0.01)。当浓度达到80 μmol/L时，PFT-α显著抑制骨髓间充质干细胞的增殖，与0，10，20，40 μmol/L PFT-α组比较差异有显著性意义(P < 0.01)，见图2。实验结果显示PFT-α浓度≤20 μmol/L时对骨髓间充质干细胞无细胞毒性，对骨髓间充质干细胞的增殖有一定促进作用，而当其浓度高于40 μmol/L则具有明显的细胞毒副作用。

Figure 2 Effects of P53 inhibitor on the cytotoxicity of bone marrow mesenchymal stem cells

图2 P53抑制剂对骨髓间充质干细胞细胞毒性的检测结果

2.3 不同处理组骨髓间充质干细胞的凋亡率各组骨髓间充质干细胞在诱导后24 h均有一定比例的凋亡细胞，流式结果显示，5-氮杂胞苷组骨髓间充质干细胞细胞凋亡率最高，与正常对照组、PFT-α组及5-氮杂胞苷+PFT-α组相比较差异有显著性意义(P < 0.01)，而PFT-α组、5-氮杂胞苷+PFT-α组与正常对照组比较，差异无显著性意义，见图3。

Figure 3 Apoptosis rate of bone marrow mesenchymal stem cells in different groups

图3 不同处理组骨髓间充质干细胞细胞凋亡率比较

2.4 不同处理组心肌样细胞的鉴定结果

不同处理组骨髓间充质干细胞诱导后1，4周肌钙蛋白Ⅰ和CX-43免疫荧光表达：诱导后1周，正常对照组未见肌钙蛋白Ⅰ和CX-43免疫荧光表达，其余3组均可见少量表达；随着诱导后时间延长，正常对照组逐渐可见微弱荧光表达，而其余3组肌钙蛋白Ⅰ和CX-43免疫荧光表达逐渐增强；诱导后4周时，可见正常对照组少量表达肌钙蛋白Ⅰ和CX-43，其余3组均强表达肌钙蛋白Ⅰ和CX-43，见图4。

图4 不同处理组骨髓间充质干细胞诱导后1，4周肌钙蛋白

Ⅰ和CX-43免疫荧光表达(×400)

Figure 4 Immunofluorescence expression of cardiac troponin Ⅰand CX-43 in the bone marrow mesenchymal stem cells in different groups after induced for 1 and 4 wk (×400)

不同处理组骨髓间充质干细胞诱导后1，4周时肌钙蛋白Ⅰ表达：诱导1周时正常对照组未见肌钙蛋白Ⅰ表达，其余3组均有少量表达，与对照组比较差异均有显著性意义(P < 0.01)，但3组间差异无显著性意义。诱导4周时，正常对照组可见少量肌钙蛋白Ⅰ表达，其余3组均有强表达，与对照组比较差异均有显著性意义(P < 0.01)，但3组间差异无显著性意义。各组肌钙蛋白Ⅰ表达在4周时均明显高于1周时的表达(P < 0.05)，见图5。

图5 不同处理组骨髓间充质干细胞诱导后1，4周时肌钙蛋白Ⅰ表达

Figure 5 Expression of cardiac troponin Ⅰ in bone marrow mesenchymal stem cells in different groups

2.5 不同处理组心肌样细胞分化率见图6。诱导4周后，流式细胞仪测定各组骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化率，5-氮杂胞苷组、PFT-α组和5-氮杂胞苷+PFT-α组与正常对照组比较差异均有显著性意义(P < 0.01)。

PFT-α组和5-氮杂胞苷+PFT-α组与5-氮杂胞苷组比较差异均有显著性意义(P < 0.01)，PFT-α组和5-氮杂胞苷+PFT-α组差异无显著性意义。

图6 不同处理组骨髓间充质干细胞分化率比较

Figure 6 Differentiation rate of bone marrow mesenchymal stem cells in different groups

2.6 不同处理组P53、P21蛋白表达见图7。诱导1周时，5-氮杂胞苷组P53、P21表达最强，PFT-α组几乎不表达，5-氮杂胞苷组与其余3组比较差异均有显著性意义(P < 0.01)，PFT-α组与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，PFT-α和5-氮杂胞苷+PFT-α组间差异无显著性意义。

诱导4周时，5-氮杂胞苷组仍强表达，其余3组表达较1周时有所增强，5-氮杂胞苷组、PFT-α组、混合组与对照组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，5-氮杂胞苷组与PFT-α组比较差异有显著性意义(P < 0.01)，其余组间差异无显著性意义。

PFT-α组、混合组组内诱导4周时P53、P21表达量与1周时比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，但5-氮杂胞苷组前后差异无显著性意义。

图7 不同处理组P53、P21蛋白表达

Figure 7 Protein expression of P53 and P21 in different groups

参考文献

[1] Elizabeth GN. Cardiovascular disease. New England J Med. 2003;349:60-72.

[2] Cao F, Sun DD, Li CX, et al. Long-term myocardial functional improvement after autologous bone marrow mononuclear cells transplantation in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: 4 years follow-up. Eur Heart J. 2009; 30(16):1986-1994.

[3] Deng W, Obrocka M, Fischer I, et al. In vitro differentiation of human marrow stromal cells into early progenitors of neural cells by conditions that increase intracellular cyclic AMP. Biochem Biophys Res Commun. 2001;282(1): 148-152.

[4] Wakitani S, Saito T, Caplan AI. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve. 1995;18:1417-1426.

[5] Makino S, Fukuda K, Miyoshi S, et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. J Clin Invest. 1999;103(5):697-705.

[6] Hong H, Takahashi K, Ichisaka T, et al. Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway. Nature. 2009;460: 1132-1136.

[7] Armesilla DA, Elvira G, Silva A. p53 regulates the proliferation, differentiation and spontaneous transformation of mesenchymal stem cells. Exp Cell Res. 2009;315: 3598-3610.

[8] Pulukuri SM, Rao JS. Activation of p53/p21Waf1/Cip1 pathway by 5-aza-2'-deoxycytidine inhibits cell proliferation, induces pro-apoptotic genes and mitogen-activated protein kinases in human prostate cancer cells. Int J Oncol. 2005;26(4): 863-871.

[9] Zhu WG, Hileman T, Ke Y, et al. 5-Aza-2,-deoxycytidine Activates the p53/p21Waf1/Cip1 Pathway to Inhibit Cell Proliferation. J Biol Chem. 2004;279(15): 15161-15166.

[10] The Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China. Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals. 2006-09-30.

[11] Bergmann O, Bhardwaj RD, Bernard S, et al. Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans. Science. 2009; 324 (5923): 98 -102.

[12] Li X,Yu X, Lin Q, et al. Bone marrow mesenchymal stem cells differentiate into functional cardiac phenotypes by cardiac microenvironment. J Mol Cell Cardiol. 2007;42(2):295-303.

[13] Wang JS, Shunr Tim D, Galipeeall J, et al. Marrou Stramol cells for cellular Cardiomyoplasty :feasibillty and potential dinical advantages. Thorae Cardiovasc Surg. 2000;120(62): 999-1005.

[14] Strauer BE, Brehm M, Zeus T, et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circulation. 2002;106 (15):1913-1918.

[15] Janssens S, Dubois C, Bogaert J, et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction:double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 2006;367(9505): 113-121.

[16] Wollert KC, Meyer GP, Lotz J, et al. Intracoronary autologous bone marrow cell transfer after myocardial infarction: The BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 2004; 364(9429) :141-148.

[17] Lago N, Trainini J, Christen A, et al. Mononuclear bone marrow stem cells implant as an alternative treatment in non-ischemic dilated cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 2006;47(4 Suppl. A):1A-384A.

[18] Wang J, Xie X, He H, et al. A prospective, randomized, controlled trial of autologous mesenchymal stem cells transplantation for dilated cardiomyopathy. Chin J Cardiol. 2006;34(2):107-111.　

[19] Komarova EA, Gudkov AV. Suppression of p53: a new app roach to overcome side effects of antitumor therapy. Biochemistry (Mosc).2000;65:41-48.

[20] Schneider SR, Diab AM, Rohrbeck A, et al. 5-aza-Cytidine is a potent inhibitor of DNA Methyltransferase 3a and induces apoptosis in HCT-116 colon cancer cells via Gadd45- and p53-Dependent Mechanisms. J Pharmacol Exp Ther. 2005; 312(2):525-536.

[21] Yan XB, Lü AL, Liu BW, et al.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(14):2482-2486.燕学波,吕安林,刘博武,等. P53-P21蛋白通路对5-氮杂胞苷诱导的大鼠骨髓间充质干细胞增殖和凋亡的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(14):2482-2486.

[22] Levine AJ, Finlay CA, Hinds PW. P53 is a Tumor Suppressor Gene. Cell. 2004;116:67-69.

[23] Schuler M, Green DR. Transcription, apoptosis and P53: catch-22. Trends Genet. 2005;21(3): 182-187.

[24] Xuwan L, Chu CC, Jinping G, et al. Pifithrin-α protects against doxorubicin-induced apoptosis and acute cardiotoxicity in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004;286: 933-939.

[25] Shave R, Baggish A, George K, et al. Exercise-induced cardiac troponin elevation: evidence, mechanisms, and implications. J Am Coll Cardiol. 2010;56(3):169-176.

[26] Janczarska K, Kie?-Wilk B, Leszczyńska-Go?abek I, et al. The role of connexin 43 in preconditioning. Impact on mitochondrial function. Kardiol Pol. 2010;68(1):91-96.

引言

材料方法

设计：分组样本对比观察。

时间及地点：于2009年9月至2010年8月在解放军第四军医大学西京医院心内科实验室完成。

材料：

实验动物：4周龄健康雄性SD大鼠，体质量(120± 20) g，SPF级，由解放军第四军医大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(军) 2008-012，实验过程中对动物的处置符合伦理学标准^[10]。

实验方法：

骨髓间充质干细胞体外分离、培养和传代：采用颈椎脱臼法处死大鼠。无菌条件下分离显露长骨骨髓腔，用L-DMEM不完全培养液冲洗骨髓腔，制成单细胞悬液。将细胞悬液缓慢加入预置有1.077 g/mL的淋巴细胞分离液的离心管中，骨髓单细胞悬液与分离液的比例为4∶6，2 000 r/min，离心20 min。吸取中间云雾状单核细胞层，加入L-DMEM不完全培养液，充分混匀后，1 500 r/min，离心10 min，弃上清，加入L-DMEM完全培养液，充分混匀后，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，接种于25 cm²塑料培养瓶，置于体积分数5% CO₂、37 ℃饱和湿度孵箱中培养。4 d后首次换液，除去不贴壁的悬浮细胞，以后每3 d换液1次。待细胞长到85%融合时，用2.5 g/L胰蛋白酶进行消化，按1∶2的比例进行传代。体外培养至第4代备用。

骨髓间充质干细胞形态学变化：每日在倒置显微镜下观察诱导前和诱导后细胞生长情况和形态学变化。

实验分组及处理：取第4代骨髓间充质干细胞，胰蛋白酶消化后分别接种于6孔板(WB检测用)，24孔板中(IHC检测用)，放置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。次日将细胞分为4组：①正常对照组：常规培养液培养。②PFT-α组：以20 μmol/L终浓度PFT-α加入培养液，24 h后去除培养液，更换不含PFT-α的常规培养液继续培养。③5-氮杂胞苷组：加入终浓度为10 μmol/L的5-氮杂胞苷培养液进行诱导。24 h后去除诱导培养液，更换不含5-氮杂胞苷的常规培养液继续培养。④PFT-α+5-氮杂胞苷组：以20 μmol/L终浓度PFT-α加入培养液，24 h后去除培养液，更换终浓度为10 μmol/L的5-氮杂胞苷培养液进行诱导。24 h后去除诱导培养液，更换不含5-氮杂胞苷的常规培养液继续培养。

PFT-α对骨髓间充质干细胞毒性测定：取第4代对数生长期骨髓间充质干细胞，以1×10⁴/孔接种于96孔培养板培养24 h，吸除培养液，分别加入含PFT-α 0，10，20，40，80 μmol/L的DMEM培养液200 μL孵育，每组5个复孔培养24 h后，每孔加四甲基偶氮唑蓝溶液(5 g/L)20 μL继续培养4 h终止培养，小心吸弃孔内培养上清液,每孔加入DMSO 150 μL振荡10 min使结晶充分溶解，用酶标仪在490 nm波长处测定各孔的吸光度(A)值。

不同处理组骨髓间充质干细胞的凋亡率检测：采用Annexin V-FITC/PI双染色法对诱导24 h后的各组骨髓间充质干细胞进行凋亡检测。将诱导24 h后的各组骨髓间充质干细胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化，PBS洗涤2次，加入300 μL的1×Binding Buffer悬浮细胞，配成浓度为1×10⁹ L^-¹的细胞悬液。加入5 μL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15 min，上机前5 min再加入5 μL的PI染色。流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

心肌样细胞的鉴定：

免疫荧光法检测各组不同时间点心肌特异性蛋白的表达：在骨髓间充质干细胞诱导1，4周时采用免疫荧光染色法分别测定肌钙蛋白Ⅰ和CX-43心肌特异性蛋白的表达。

Western Blotting法检测各组不同时间点肌钙蛋白Ⅰ的表达量：在骨髓间充质干细胞诱导1，4周时采用Western Blotting法检测肌钙蛋白Ⅰ的表达。

心肌样细胞分化率测定：各组细胞诱导4周时，采用流式细胞仪测定肌钙蛋白Ⅰ阳性标记的心肌样细胞占细胞总数的百分比。

P53、P21蛋白表达的测定：Western Blotting法检测各组不同时间点P53/P21蛋白的表达量。实验方法和过程同Western Blotting法检测肌钙蛋白Ⅰ，一抗为鼠抗P53，P21抗体。

主要观察指标：骨髓间充质干细胞培养传代过程中的细胞形态变化，四甲基偶氮唑蓝法测定诱导后骨髓间充质干细胞增殖能力，流式细胞仪检测诱导后细胞凋亡率及心肌样细胞分化率，免疫荧光法和Western blotting法鉴定心肌细胞。

统计学分析：由第一作者采用GraphPad Prism 5统计软件对各组数据进行t 检验和单因素方差分析，各组数据均以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

心血管疾病特别是心肌梗死的发生率逐年升高。虽然有研究表明，心肌细胞会缓慢地更新，但是其更新率也在缓慢地不断下降[11]。因此心肌梗死后，坏死心肌的修复成为患者治疗成功的关键。心脏移植供体来源困难，手术技能要求高，费用昂贵，难以在临床推广。自体心肌细胞移植替代治疗用于心肌重建，因存在自体心肌细胞培养棘手，获得的细胞数量有限，移植后存活率低等问题而只能取得有限的成果。近年来大量的动物实验及临床研究已经证明了骨髓间充质干细胞移植治疗心脏疾病特别是缺血性心脏病的显著疗效[2, 12-18]。

P53特异性抑制剂PFT-α最早用于研究抗肿瘤药物毒副作用[19]，Schneider等[20]在研究5-氮杂胞苷诱导大肠癌细胞系HCT-116凋亡机制中P53的作用时，观察了PFT-α对HCT-116的细胞毒性，当PFT-α浓度在 30 μmol/L或者低于30 μmol/L时，并不抑制HCT-116的生长，而当浓度高于30 μmol/L时则对HCT-116的生长产生抑制，具有一定的细胞毒副作用。

实验应用不同浓度PFT-α作用于骨髓间充质干细胞，观察其对细胞增殖的影响，发现当PFT-α在20 μmol/L或者低于20 μmol/L时，对于骨髓间充质干细胞的生长没有任何抑制，甚至促进细胞增殖，而当浓度达到 40 μmol/L时则对骨髓间充质干细胞增殖产生抑制，这种抑制效应在浓度达80 μmol/L时更为显著，抑制效应呈浓度依赖性增强。因此，作者认为PFT-α浓度在等于或者低于20 μmol/L时对骨髓间充质干细胞的增殖无抑制，相反，能促进细胞增殖。同时，实验还观察了PFT-α对5-氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞凋亡的影响，结果显示，经PFT-α作用24 h后，5-氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞的凋亡率显著减少，而骨髓间充质干细胞 P53、P21蛋白表达量显著下降。因此认为，PFT-α是通过阻断P53，从而抑制下游P21基因激活起作用的[21]。

p53基因位于人类染色体17p13.1，基因全长16- 20 kb，由11个外显子和10个内含子组成，其启动子不含CAAT盒、TATA盒和GC盒等常见启动序列。转录产生2.5 kb mRNA，翻译生成的蛋白质由393个氨基酸残基组成，相对分子质量为53 000，所以称为p53基因[22]。p53属于抑癌基因，可参与细胞周期的调控，在DNA修复、细胞凋亡、抑制肿瘤增殖过程中起重要作用[23]。其编码的P53蛋白在细胞损伤的情况下可诱导激活下游P21蛋白，触发DNA修复和细胞凋亡。最新研究表明，P53-P21蛋白通路不仅具有抑制细胞癌变、阻止肿瘤生长的作用，同时能抑制干细胞的分化和增殖。通过阻断P53-P21蛋白通路，能显著提高iPS的分化率[6]。而5-氮杂胞苷主要通过激活P53-P21蛋白通路，抑制细胞增殖，导致细胞凋亡。PFT-α能够特异性、可逆性的抑制P53活性，从而减少细胞的凋亡，提高细胞的生存率，同时又不会导致肿瘤的发生[20, 24]。

本实验结果显示，通过阻断P53-P21蛋白通路，能减少骨髓间充质干细胞凋亡，促进其增殖。骨髓间充质干细胞经PFT-α诱导后能表达肌钙蛋白Ⅰ和CX-43，肌钙蛋白Ⅰ为心肌肌钙蛋白3种亚单位之一，通过依赖Ca2+的调节来控制心肌的收缩[25]。而CX-43是心肌组织中含量最为丰富的连接蛋白，主要存在于工作心肌中，与心肌细胞间的信息传递密切相关[26]，肌钙蛋白Ⅰ和CX-43均为心肌细胞特异性蛋白，而正常对照组基本不表达肌钙蛋白Ⅰ和CX-43，5-氮杂胞苷组同样能表达肌钙蛋白Ⅰ和CX-43，因此证明PFT-α能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。通过流式细胞仪检测分化率发现PFT-α诱导分化率明显高于传统5-氮杂胞苷，其机制可能是PFT-α阻断了P53蛋白的活性，从而抑制了下游P21蛋白的表达，进而诱发启动下游心肌细胞相关基因的表达。但是联合诱导组分化率和PFT-α组差异无显著性意义，这可能与PFT-α抑制了5-氮杂胞苷去甲基化水平有关，具体机制仍有待进一步研究和探索。

实验通过PFT-α诱导大鼠骨髓间充质干细胞后，不仅能显著减少5-氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞的凋亡，而且促进5-氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞的增殖。不仅细胞形态学发生心肌样变化，而且免疫荧光染色强表达肌钙蛋白Ⅰ和CX-43，Western Blotting也表达肌钙蛋白Ⅰ，这些结果均表明PFT-α能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化，且诱导分化率明显高于传统5-氮杂胞苷。其机制可能与P53-P21蛋白通路的失活有关，为进一步研究骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化提供了新的基础。

P53特异性抑制剂PFT-α诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into cardiomyocyte-likecells induced by P53 specific inhibitor p-fifty three inhibitor-alpha

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 7

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[3]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[4]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[5]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[6]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[7]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[8]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[9]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[10]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[11]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[12]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[13]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.
[14]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
[15]	樊全宝, 罗惠娜, 王丙云, 陈胜锋, 崔连旭, 江文康, 赵明明, 王静静, 罗冬章, 陈志胜, 白银山, 刘璨颖, 张晖. 低氧培养犬脂肪间充质干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1002-1007.